Pomysłodawcą i opiekunem merytorycznym projektu
jest dr n. wet. Dariusz Jagielski.

„Na początku mojej pracy z pacjentami onkologicznymi, niemal dwadzieścia lat temu, zajmowałem się immunofenotypowaniem i cytometrią przepływową, będąc oczarowanym potencjałem tej metody diagnostycznej. Wreszcie udało się zebrać w naszym kraju grupę osób, które oferują cytometrię przepływową jako standardowe i komercyjne badanie diagnostyczne dla pacjentów z nowotworami układu krwiotwórczego. Założeniem całości jest bezpośredni kontakt z lekarzem zajmującym się pacjentem – to z pewnością będzie skutkowało uzyskaniem z badania cytometrycznego dodatkowych i przydatnych klinicznie informacji.”

Nasz zespół

Nasz zespół tworzą wykwalifikowani cytometryści pod opieką doświadczonego pracownika Vetlabu, specjalisty z zakresu weterynaryjnej diagnostyki laboratoryjnej – dr n. med. lek. wet. Marty Idziak.

Naukowego wsparcia udziela nam dr hab. n. wet. Aleksandra Pawlak z Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu.

“Cytometria przepływowa jest jedną z podstawowych metod badawczych jakie stosuję w swojej pracy naukowej. Cytometryczna immunofenotypizacja chłoniaków i białaczek u psów była jednym z aspektów mojej pracy doktorskiej i od tego czasu pozostaję prawdziwą entuzjastką tej metody diagnostycznej, stale rozwijając się i szkoląc w zakresie jej wykorzystania. Komercjalizacja efektów badań naukowych w postaci wprowadzenia na polski rynek nowej usługi diagnostycznej jest dla mnie doskonałym ukoronowaniem pracy naukowej – bo nauka powinna służyć praktyce!”

Zapraszamy do współpracy wszystkich lekarzy zainteresowanych onkologią weterynaryjną, chcących pogłębić diagnostykę hematoonkologiczną swoich pacjentów.

Jesteśmy również otwarci na współpracę z ośrodkami naukowymi.

CYTOMETRIA PRZEPŁYWOWA

Cytometria przepływowa jest metodą wykorzystywaną powszechnie w diagnostyce laboratoryjnej. Przy jej użyciu, na podstawie detekcji światła laserowego skanującego zawiesinę komórkową, możliwa jest precyzyjna ocena liczby i cech morfologicznych komórek. Od początku naszego istnienia korzystamy z najnowocześniejszych na rynku weterynaryjnym cytometrów przepływowych, oferując Państwu profesjonalne oznaczenia parametrów morfologicznych krwi u wielu gatunków zwierząt.

Obecnie, jako jedyni w Polsce, dzięki połączeniu technologii cytometrii przepływowej, przeciwciał monoklonalnych i fluorescencji, mamy możliwość wykonywania zaawansowanej oceny immunofenotypu komórek. W badaniu tym wykrywamy obecność antygenów różnicowania (ang. clusters of differentiation, CD), na powierzchni i wewnątrz komórek, co pozwala na precyzyjne ustalenie ich pochodzenia.

WSKAZANIA DO IMMUNOFENOTYPIZACJI

Immunofenotypizacja w medycynie weterynaryjnej znajduje zastosowanie przede wszystkim w hematoonkologii małych zwierząt.
W pierwszych latach naszej działalności oferowaliśmy to badanie wyłącznie psim pacjentom. Obecnie możliwe jest jego wykonanie również u kotów.
Dodatkowo naszą ofertę rozszerzyliśmy o badanie antygenu Ki-67 u psów – markera proliferacji komórek, pomocnego w ocenie stopnia agresywności nowotworów.

Podstawowe wskazania do immunofenotypizacji metodą cytometrii przepływowej u psów i kotów to:

różnicowanie reaktywnych i nowotworowych procesów limfoproliferacyjnych (limfocytoza/węzeł chłonny reaktywny vs. białaczka/chłoniak)

różnicowanie ostrych i przewlekłych białaczek (uwaga! tylko pies)

różnicowanie pochodzenia komórek chłoniaka (T vs. B-komórkowe)

różnicowanie pochodzenia komórek białaczki (limfoidalne vs. mielomonoidalne)

ocena parametrów rokowniczych w przebiegu chłoniaka/białaczki (fenotyp, aberracje, ekspresja cząsteczek MHCII)

różnicowanie chłoniaków o niskim i wysokim stopniu agresywności (Ki-67; uwaga! tylko pies)

jednoznaczne potwierdzenie występowania chłoniaka strefy T (uwaga! tylko pies)

różnicowanie grasiczaka i chłoniaka śródpiersia (uwaga! tylko pies)

Panel używanych przez nas przeciwciał monoklonalnych obejmuje:

w przypadku psów przeciwciała skierowane przeciwko wszystkim wymienionym poniżej markerom
w przypadku kotów wyłącznie przeciwciała skierowane przeciwko markerom oznaczonym

CD45 / CD18

marker leukocytów

CD34

marker komórek macierzystych

CD3

marker limfocytów T (powierzchniowy)

CD3c

marker limfocytów T (wewnątrzkomórkowy)

CD4

marker limfocytów T pomocniczych

CD8

marker limfocytów T cytotoksycznych

CD5

marker limfocytów T

CD21

marker dojrzałych limfocytów B (powierzchniowy)

CD79α

marker limfocytów B (wewnątrzkomórkowy)

CD14

marker linii monoidalnej

MHCII

marker Głównego Układu Zgodności Tkankowej klasy II (obecny na limfocytach i makrofagach)

CD11b

marker linii mielomonoidalnej

Ki-67

marker aktywności proliferacyjnej komórek

WAŻNE INFORMACJE

Badanie immunofenotypu komórek metodą cytometrii przepływowej wymaga zachowania ich wysokiej żywotności. Z tego powodu może być ono wykonane nie później niż przed upływem 48h-72h od momentu pobrania materiału komórkowego.
W przypadku badania cytometrycznego bioptatów węzłów chłonnych/narządów litych konieczne jest przygotowanie zawiesiny materiału komórkowego z użyciem specjalnego medium (Instrukcja). Zasada ta nie dotyczy krwi, szpiku kostnego i płynów z jam ciała, które są gotowymi do analizy zawiesinami komórek.
Materiału komórkowego nie należy zamrażać ani utrwalać.
Próby do badań cytometrycznych przyjmowane są w dniach: od poniedziałku do czwartku (analizy nie będą wykonywane w weekendy i dni świąteczne).
Istotny wpływ na wyniki immunfenotypizacji mają stosowane leki, zwłaszcza cytostatyki i glikokortykosteroidy. Z tego powodu zaleca się wykonywanie badania przed rozpoczęciem terapii.
Wyniki immunofenotypizacji nie mogą być interpretowane bez wiedzy o obrazie cytopatologicznym analizowanego materiału oraz danych klinicznych pacjenta. Z tego powodu konieczne jest uzupełnienie ankiety internetowej oraz przesłanie świeżych preparatów i/lub wyników badań cytologicznych.

MATERIAŁ DO BADANIA

Materiałem do badania immunofenotypu metodą cytometrii przepływowej może być każdy rodzaj płynnej zawiesiny żywych komórek.
Jeśli analizie ma zostać poddana krew obwodowa, szpik kostny lub płyn z jam ciała – materiał ten należy pobrać do probówki z antykoagulantem (jak do badania morfologii krwi) i przesłać do laboratorium.
W przypadkach bioptatów z węzłów chłonnych i innych narządów litych konieczne jest zawieszanie komórek w specjalnym medium transportowym.

Instrukcja przygotowania medium transportowego dla bioptatów węzłów chłonnych/narządów litych

Do probówki z EDTA pobrać krew obwodową pacjenta, od którego pobierana jest biopsja.
Odwirować uzyskaną próbkę krwi, celem otrzymania osocza.
Uzyskane osocze zmieszać z jałowym 0,9% roztworem NaCl w stosunku 1:9. Do przygotowania próby od jednego pacjenta wystarczają około 2 ml medium (1,8 ml 0.9% NaCl + 0,2 ml osocza).
Bioptat komórek umieścić w tak przygotowanym medium.

Minimalna komórkowość materiału umożliwiająca przeprowadzenie badania to ok. 3 mln żywych komórek. Objętość próbki jaką należy przesłać do analizy zależy od ilości komórek w badanej tkance i jest trudna do sprecyzowania (zwykle wystarczające są ok. 2-3 pobrania bioptatu węzła, ok. 2-3 ml krwi obwodowej, ok. 1-2 ml szpiku kostnego).

Wskazane jest, aby wraz z materiałem komórkowym dostarczyć do badania preparaty mikroskopowe i/lub wyniki aktualnych badań cytopatologicznych.

ANKIETA DLA LEKARZA
ZLECAJĄCEGO BADANIE

WYPEŁNIJ ANKIETĘ DO BADANIA

CIEKAWE PRZYPADKI

Poniżej prezentujemy krótkie opisy przypadków, które ukazują potencjał diagnostyczny badania immunofenotypu komórek nowotworowych psów metodą cytometrii przepływowej.

Sznaucer z klinicznym podejrzeniem chłoniaka

10-letni sznaucer z klinicznym podejrzeniem chłoniaka, które zostało potwierdzone badaniem cytopatologicznym węzłów chłonnych
w celu oceny klonalności rozrostu oraz pochodzenia komórek nowotworowych wykonano badanie PARR, które zaskakująco dało wynik ujemny (stwierdzono cechy proliferacji poliklonalnej z limfocytów T i B, jak w nienowotworowym pobudzeniu węzła chłonnego)
wyniki analizy cytometrycznej wykazały, że dominującą populację w badanym węźle chłonnym stanowiły komórki średniej wielkości/duże, o immunofenotypie CD45+CD21+CD79α+MHCII+. Taki wynik oznaczał zachwianie fizjologicznych proporcji między limfocytami T i B w węźle chłonnym i wyraźnie sugerował nadmierny rozrost limfocytów B*. Uwzględniając dane kliniczne i wynik cytologii węzła chłonnego pacjenta, immunofenotypizacja pozwoliła na rozwianie wątpliwości co do ostatecznego rozpoznania – stwierdzono występowanie chłoniaka B-komórkowego i wdrożono odpowiednią terapię.

*Pawlak A, et al. Immunophenotypic characterization of canine malignant lymphoma: a retrospective study of cases diagnosed in Poland Lower Silesia, over the period 2011–2013. Veterinary and Comparative Oncology, 2014, 14, 52–59.

Shih-tzu z objawami uogólnionej limfadenomegalii i wyraźną limfocytozą we krwi obwodowej

11-letni Shih-tzu z objawami uogólnionej limfadenomegalii i wyraźną limfocytozą we krwi obwodowej, utrzymującymi się od około roku
wykonane na początku procesu diagnostycznego badanie histopatologiczne usuniętego węzła podżuchwowego sugerowało jego reaktywną hiperplazję, co nie korelowało z obrazem klinicznym pacjenta
wynik immunofenotypizacji wskazał na obecność w badanym węźle wyraźnie dominującej populacji komórek o immunofenotypie: CD45-CD3+CD8+CD5+MHCII+. Występowanie tak licznej populacji komórek o fenotypie limfocytów T cytotoksycznych, ale pozbawionych ekspresji markera leukocytów (CD45), świadczyło o ich transformacji nowotworowej.

Immunofenotypizacja pozwoliła w tym przypadku potwierdzić występowanie podejrzewanego klinicznie chłoniaka oraz, zgodnie z danymi literaturowymi, zasugerować jego podtyp jako chłoniaka strefy T (TZL)*.

*Seelig DM, Avery P, et al. Canine T-zone lymphoma: unique immunophenotypic features, outcome, and population characteristics. J Vet Intern Med 2014; 28: 878-86.

Bokser z uogólnioną limfadenomegalią i cytologicznym podejrzeniem chłoniaka limfoblastycznego

7-letni bokser z uogólnioną limfadenomegalią i cytologicznym podejrzeniem chłoniaka limfoblastycznego
analiza cytometryczna pozwoliła na identyfikację wyraźnie dominującej w badanych węzłach chłonnych populacji komórek o fenotypie: CD45+CD3+CD5+CD4+, który odpowiada pomocniczym limfocytom T. Tym samym, dzięki immunofenotypizacji szybko i jednoznacznie potwierdzono obecność chłoniaka, dodatkowo stwierdzając jego T-komórkowe pochodzenie. Zasugerowano również, iż wedle danych literaturowych fenotyp CD45+CD4+ w przypadkach chłoniaków T-komórkowych pozwala przewidywać agresywny charakter i szybką progresję nowotworu*, a boksery uznawane są za rasę predysponowaną do tego typu rozrostów**.

*Avery PR, Burton JL, et al. Flow cytometric characterization and clinical outcome of CD4+ T-Cell Lymphoma in dogs: 67 cases. J Vet Intern Med 2014; 28: 538-546.
**Lurie DM, Milner RJ, et al. Immunophenotypic ad cytomorphologic subclassification of T-cell lymphoma in the boxer breed. Vet Immunology and Immunopathology 2008; 125: 102-110.

Mieszaniec w ciężkim stanie ogólnym, z silną leukocytozą i obecnością komórek atypowych w rozmazie krwi obwodowej

9-letni mieszaniec w ciężkim stanie ogólnym, z silną leukocytozą i obecnością komórek atypowych w rozmazie krwi obwodowej, anemią oraz małopłytkowością
w wyniku analizy cytometrycznej krwi odnotowano bardzo wyraźnie dominującą populację komórek macierzystych (CD34+), o równoczesnej ekspresji markera limfocytów B (CD79α+).
Fenotypowane komórki nie wykazywały ekspresji markerów CD14 oraz CD4, co pozwoliło z wysokim prawdopodobieństwem wykluczyć linię mielomonocytarną rozrostu. Immunofenotypizacja była w tym przypadku podstawą do ustalenia ostatecznego rozpoznania – ostrej białaczki limfoblastycznej typu B (ALL-B)*.

* Vernau W, Moore PF. An immunophenotypic study of canine leukemias and preliminary assessment of clonality by polymerase chain reaction. Vet Immunol Immunopathol 1999; 69: 145-164.

Sznaucer miniaturowy - pacjent niewykazujący objawów klinicznych, z utrzymującą się od kilku miesięcy znaczną limfocytozą

15-letni sznaucer miniaturowy – pacjent niewykazujący objawów klinicznych, z utrzymującą się od kilku miesięcy znaczną limfocytozą, bez obecności komórek atypowych we krwi obwodowej
obraz analizy cytometrycznej krwi pacjenta został zdominowany przez populację komórek o fenotypie: CD45+CD21+CD79α+MHCII+, odpowiadającą limfocytom B. Jednocześnie brak ekspresji markera komórek macierzystych (CD34) przez badane komórki wykluczał wystąpienie ostrej białaczki limfoblastycznej. Wynik badania immunofenotypu w tym przypadku (w kontekście danych klinicznych pacjenta i wyników rozmazu krwi obwodowej) za najbardziej prawdopodobne pozwolił uznać występowanie przewlekłej białaczki limfocytarnej z limfocytów B (CLL-B), ewentualnie chłoniaka z małych limfocytów B (SLL-B) z zajęciem krwi obwodowej*.

*Comazzi S, Gelain ME, Martini V. Immunophenotype Predicts Survival Time in Dogs with Chronic Lymphocytic Leukemia. JVIM 2011: 25; 100-106.

Kot z przewlekłą limfocytozą o niejasnym pochodzeniu

12-letni kot z utrzymującą się ponad 2 miesiące limfocytozą i nieznacznymi cechami atypii prezentowanymi przez limfocyty w badaniu mikroskopowym rozmazu
analiza cytometryczna próbki krwi pacjenta pozwoliła na identyfikację wyraźnie dominującej w populacji limfocytów subpopulacji komórek o fenotypie CD18+CD5+CD4+, który odpowiada limfocytom T pomocniczym. Zgodnie z danymi literaturowymi* taki wynik immunofenotypowania jest silną sugestią procesu nowotworowego linii limfoidalnej (białaczki lub chłoniaka w stadium białaczkowym).

*Rout E.D., et al. Immunophenotypic characterization and clinical outcome in cats with lymphocytosis. Journal of veterinary internal medicine 2020; 34: 105-116.

KONTAKT

Vetlab Warszawa

tel. 48 22 201 16 49
Aleja Krakowska 110/114 bud. B-55
02-256 Warszawa

cytometria@vetlab.pl

osoby do kontaktu:

dr n. med. lek. wet. Marta Idziak
lek. wet. Edyta Czech

Pomysłodawcą i opiekunem merytorycznym projektu jest dr n. wet. Dariusz Jagielski.