Immunofenotypowanie
metodą cytometrii przepływowej

  • Zaawansowana technologia.
  • Precyzyjne i szybkie wyniki.
  • Lepsze wsparcie decyzji klinicznych.

Nowoczesna diagnostyka hematologiczna i onkologiczna wymagają narzędzi wykraczających poza ocenę morfologiczną komórek. Immunofenotypowanie metodą cytometrii przepływowej umożliwia wieloparametrową analizę ekspresji antygenów komórkowych, dzięki czemu możliwe jest obiektywne i precyzyjne określenie pochodzenia i stopnia zróżnicowania komórek, w tym identyfikacja komórek nowotworowych.

W medycynie weterynaryjnej badanie znajduje obecnie zastosowanie w szczegółowej diagnostyce chłoniaków i białaczek u psów i kotów. Szybki i szczegółowy wynik badania daje lekarzom weterynarii jasność niezbędną do podejmowania trafnych i terminowych decyzji terapeutycznych.

Nasz zespół

Tam, gdzie nauka spotyka się z praktyką

W Vetlabie wierzymy, że kluczem do sukcesu jest stała współpraca patologów klinicznych i diagnostów laboratoryjnych z lekarzami weterynarii oraz naukowcami. Dziś z dumą wyróżniamy się jako jedyne laboratorium weterynaryjne w Polsce oferujące immunofenotypowanie metodą cytometrii przepływowej. Jest to efektem wspólnych starań naszego zespołu cytometrystów oraz uznanych specjalistów w swoich dziedzinach.

dr n. wet. Dariusz Jagielski
onkolog weterynaryjny, wykładowca akademicki

“Na początku mojej pracy z pacjentami onkologicznymi, niemal dwadzieścia lat temu, zajmowałem się immunofenotypowaniem i cytometrią przepływową, będąc oczarowanym potencjałem tej metody diagnostycznej. Wreszcie udało się zebrać w naszym kraju grupę osób, które oferują cytometrię przepływową jako standardowe i komercyjne badanie diagnostyczne dla pacjentów z nowotworami układu krwiotwórczego. Założeniem całości jest bezpośredni kontakt z lekarzem zajmującym się pacjentem – to z pewnością będzie skutkowało uzyskaniem z badania cytometrycznego dodatkowych i przydatnych klinicznie informacji.”

dr hab. n. wet. Aleksandra Pawlak
badaczka, cytometrystka, wykładowczyni akademicka

“Cytometria przepływowa jest jedną z podstawowych metod badawczych jakie stosuję w swojej pracy naukowej. Cytometryczna immunofenotypizacja chłoniaków i białaczek u psów była jednym z aspektów mojej pracy doktorskiej i od tego czasu pozostaję prawdziwą entuzjastką tej metody diagnostycznej, stale rozwijając się i szkoląc w zakresie jej wykorzystania. Komercjalizacja efektów badań naukowych w postaci wprowadzenia na polski rynek nowej usługi diagnostycznej jest dla mnie doskonałym ukoronowaniem pracy naukowej – bo nauka powinna służyć praktyce!”

Marta_Idziak

dr n. med. lek. wet. Marta Idziak
CASVM/LabDiag., specjalistka weterynaryjnej diagnostyki laboratoryjnej

„Od początku pracy zawodowej głównym przedmiotem moich działań i zainteresowań jest zwierzęca komórka. Hodowle komórkowe i badania nad komórkami macierzystymi, ocena mikroskopowa rozmazów krwi, badania cytologiczne aż w końcu analizy wyników immunofenotypowania komórek chłoniaków i białaczek. Łączenie tych doświadczeń pozwala mi widzieć i rozumieć więcej, a dzielenie się tą wiedzą z klinicystami daje dużo zawodowej satysfakcji”.

Wskazania do badania

Immunofenotyp ma znaczenie

Wskazania do wykonania immunofenotypowania u psów i kotów skupiają się przede wszystkim wokół pacjentów z limfocytozą niejasnego tła oraz rozpoznanym lub podejrzewanym chłoniakiem lub białaczką. Badanie warto zlecić, kiedy istnieje potrzeba różnicowania:

  • nowotworowego i odczynowego podłoża limfocytozy,
  • reaktywnej hiperplazji węzła chłonnego/śledziony i chłoniaka,
  • chłoniaka T- i B-komórkowego (i oceny innych parametrów rokowniczych),
  • ostrej i przewlekłej białaczki (uwaga! tylko u psa),
  • białaczki z linii limfoidalnej i mieloidalnej,
  • grasiczaka i chłoniaka śródpiersia (uwaga! tylko u psa),
  • potwierdzenia podtypu chłoniaka strefy T u psa (TZL).

Różnice w możliwości zastosowania badania w diagnostyce psich i kocich pacjentów wynikają z wielu czynników. Jednym z nich jest ograniczona dostępność przeciwciał monoklonalnych do wykrywania kocich antygenów komórkowych w porównaniu z psami.

W Vetlabie wykrywamy następujące markery komórkowe (ang. CD, clusters of differentiation) u psów i kotów:

CD45 / CD18​

marker leukocytów

CD34

marker komórek macierzystych

CD3

marker limfocytów T (powierzchniowy)

CD3c

marker limfocytów T (wewnątrzkomórkowy)

CD4

marker limfocytów T pomocniczych

CD8

marker limfocytów T cytotoksycznych

CD5

marker limfocytów T

CD21

marker dojrzałych limfocytów B (powierzchniowy)

CD79α​

marker limfocytów B (wewnątrzkomórkowy)

CD14

marker linii monoidalnej

MHCII

marker Głównego Układu Zgodności Tkankowej klasy II (obecny na limfocytach i makrofagach)

CD11b

marker linii mielomonoidalnej

Ki-67

marker aktywności proliferacyjnej komórek​ chłoniaków i przewlekłych białaczek
B-komórkowych

Materiał do badania

Pozwólmy komórkom popłynąć…

Materiałem do badania immunofenotypu metodą cytometrii przepływowej jest zawsze materiał PŁYNNY i zawierający ŻYWE KOMÓRKI, których cechy chcemy ocenić.

  • Jeśli analizie ma zostać poddana krew, szpik kostny lub płyn z jamy ciała – materiały te spełniają oba powyższe warunki i są gotowe do badania. Pobrać je należy do probówki z antykoagulantem (jak do badania morfologii krwi).
  • W przypadkach bioptatów cienkoigłowych z węzłów chłonnych i innych narządów litych konieczne jest zawieszanie komórek w specjalnym medium transportowym, według poniższej instrukcji:
  1. Do probówki z EDTA pobrać krew obwodową pacjenta, od którego pobierana jest biopsja.
  2. Odwirować uzyskaną próbkę krwi, celem otrzymania osocza.
  3. Uzyskane osocze zmieszać z jałowym 0,9% roztworem NaCl w stosunku 1:9. Do przygotowania próby od jednego pacjenta wystarczają około 2 ml medium (1,8 ml 0.9% NaCl + 0,2 ml osocza).
  4. Bioptat komórek umieścić w tak przygotowanym medium.

Ważne informacje

  • Badanie immunofenotypu komórek metodą cytometrii przepływowej wymaga zachowania ich wysokiej żywotności. Z tego powodu może być ono wykonane nie później niż przed upływem 48h od momentu pobrania materiału komórkowego.
  • Badanie wykonywane jest przez zespół cytometrystów Vetlab Warszawa.
    Próby do badań cytometrycznych przyjmowane są w Warszawie w dniach: od poniedziałku do czwartku (analizy nie są wykonywane w weekendy i dni świąteczne).
  • Materiału komórkowego nie należy zamrażać ani utrwalać.
  • Próbówki z materiałem komórkowym należy transportować i przechowywać w stanie schłodzenia (temperatura 4-8 C).
  • Istotny wpływ na wyniki immunofenotypowania mają stosowane leki, zwłaszcza cytostatyki i glikokortykosteroidy. Z tego powodu zaleca się wykonywanie badania przed rozpoczęciem terapii.
  • Wyniki immunofenotypowania nie mogą być interpretowane bez wiedzy o obrazie cytopatologicznym analizowanego materiału oraz danych klinicznych pacjenta. Z tego powodu konieczne jest uzupełnienie ankiety internetowej oraz przesłanie świeżych preparatów i/lub wyników badań cytologicznych.

OPOWIEDZ NAM
O SWOIM PACJENCIE

Wypełnij ankietę do badania

Ciekawe przypadki

Zobacz, jak możemy pomóc

Poniżej prezentujemy krótkie opisy przypadków, które ukazują potencjał diagnostyczny badania immunofenotypu komórek psów i kotów metodą cytometrii przepływowej.

Sznaucer z klinicznym podejrzeniem chłoniaka

  • 10-letni sznaucer z klinicznym podejrzeniem chłoniaka, które zostało potwierdzone badaniem cytopatologicznym węzłów chłonnych
  • w celu oceny klonalności rozrostu oraz pochodzenia komórek nowotworowych wykonano badanie PARR, które zaskakująco dało wynik ujemny (stwierdzono cechy proliferacji poliklonalnej z limfocytów T i B, jak w nienowotworowym pobudzeniu węzła chłonnego)
  • wyniki analizy cytometrycznej wykazały, że dominującą populację w badanym węźle chłonnym stanowiły komórki średniej wielkości/duże, o immunofenotypie CD45+CD21+CD79α+MHCII+. Taki wynik oznaczał zachwianie fizjologicznych proporcji między limfocytami T i B w węźle chłonnym i wyraźnie sugerował nadmierny rozrost limfocytów B*. Uwzględniając dane kliniczne i wynik cytologii węzła chłonnego pacjenta, immunofenotypowanie pozwoliło na rozwianie wątpliwości co do ostatecznego rozpoznania – stwierdzono występowanie chłoniaka B-komórkowego i wdrożono odpowiednią terapię.

*Pawlak A, et al. Immunophenotypic characterization of canine malignant lymphoma: a retrospective study of cases diagnosed in Poland Lower Silesia, over the period 2011–2013. Veterinary and Comparative Oncology, 2014, 14, 52–59.

 

Shih-tzu z objawami uogólnionej limfadenomegalii i wyraźną limfocytozą we krwi obwodowej

  • 11-letni Shih-tzu z objawami uogólnionej limfadenomegalii i wyraźną limfocytozą we krwi obwodowej, utrzymującymi się od około roku
  • wykonane na początku procesu diagnostycznego badanie histopatologiczne usuniętego węzła podżuchwowego sugerowało jego reaktywną hiperplazję, co nie korelowało z obrazem klinicznym pacjenta
  • wynik immunofenotypowania wskazał na obecność w badanym węźle wyraźnie dominującej populacji komórek o immunofenotypie: CD45-CD3+CD8+CD5+MHCII+. Występowanie tak licznej populacji komórek o fenotypie limfocytów T cytotoksycznych, ale pozbawionych ekspresji markera leukocytów (CD45), świadczyło o ich transformacji nowotworowej. 

Immunofenotypowanie pozwoliło w tym przypadku potwierdzić występowanie podejrzewanego klinicznie chłoniaka oraz, zgodnie z danymi literaturowymi, zasugerować jego podtyp jako chłoniaka strefy T (TZL)*.

*Seelig DM, Avery P, et al. Canine T-zone lymphoma: unique immunophenotypic features, outcome, and population characteristics. J Vet Intern Med 2014; 28: 878-86.

 

Bokser z uogólnioną limfadenomegalią i cytologicznym podejrzeniem chłoniaka limfoblastycznego

  • 7-letni bokser z uogólnioną limfadenomegalią i cytologicznym podejrzeniem chłoniaka limfoblastycznego
  • analiza cytometryczna pozwoliła na identyfikację wyraźnie dominującej w badanych węzłach chłonnych populacji komórek o fenotypie: CD45+CD3+CD5+CD4+, który odpowiada pomocniczym limfocytom T. Tym samym, dzięki immunofenotypowaniu szybko i jednoznacznie potwierdzono obecność chłoniaka, dodatkowo stwierdzając jego T-komórkowe pochodzenie. Zasugerowano również, iż wedle danych literaturowych fenotyp CD45+CD4+ w przypadkach chłoniaków T-komórkowych pozwala przewidywać agresywny charakter i szybką progresję nowotworu*, a boksery uznawane są za rasę predysponowaną do tego typu rozrostów**.

 

*Avery PR, Burton JL, et al. Flow cytometric characterization and clinical outcome of CD4+ T-Cell Lymphoma in dogs: 67 cases. J Vet Intern Med 2014; 28: 538-546.
**Lurie DM, Milner RJ, et al. Immunophenotypic ad cytomorphologic subclassification of T-cell lymphoma in the boxer breed. Vet Immunology and Immunopathology 2008; 125: 102-110.

 

Mieszaniec w ciężkim stanie ogólnym, z silną leukocytozą i obecnością komórek atypowych w rozmazie krwi obwodowej

  • 9-letni mieszaniec w ciężkim stanie ogólnym, z silną leukocytozą i obecnością komórek atypowych w rozmazie krwi obwodowej, anemią oraz małopłytkowością
  • w wyniku analizy cytometrycznej krwi odnotowano bardzo wyraźnie dominującą populację komórek macierzystych (CD34+), o równoczesnej ekspresji markera limfocytów B (CD79α+).
    Fenotypowane komórki nie wykazywały ekspresji markerów CD14 oraz CD4, co pozwoliło z wysokim prawdopodobieństwem wykluczyć linię mielomonocytarną rozrostu. Immunofenotypowanie było w tym przypadku podstawą do ustalenia ostatecznego rozpoznania – ostrej białaczki limfoblastycznej typu B (ALL-B)*.

 

* Vernau W, Moore PF. An immunophenotypic study of canine leukemias and preliminary assessment of clonality by polymerase chain reaction. Vet Immunol Immunopathol 1999; 69: 145-164.

 

Sznaucer miniaturowy - pacjent niewykazujący objawów klinicznych, z utrzymującą się od kilku miesięcy znaczną limfocytozą

  • 15-letni sznaucer miniaturowy – pacjent niewykazujący objawów klinicznych, z utrzymującą się od kilku miesięcy znaczną limfocytozą, bez obecności komórek atypowych we krwi obwodowej
  • obraz analizy cytometrycznej krwi pacjenta został zdominowany przez populację komórek o fenotypie: CD45+CD21+CD79α+MHCII+, odpowiadającą limfocytom B. Jednocześnie brak ekspresji markera komórek macierzystych (CD34) przez badane komórki wykluczał wystąpienie ostrej białaczki limfoblastycznej. Wynik badania immunofenotypu w tym przypadku (w kontekście danych klinicznych pacjenta i wyników rozmazu krwi obwodowej)  za najbardziej prawdopodobne pozwolił uznać występowanie przewlekłej białaczki limfocytarnej z limfocytów B (CLL-B), ewentualnie chłoniaka z małych limfocytów B (SLL-B) z zajęciem krwi obwodowej*.

*Comazzi S, Gelain ME, Martini V. Immunophenotype Predicts Survival Time in Dogs with Chronic Lymphocytic Leukemia. JVIM 2011: 25; 100-106.

 

Kot z przewlekłą limfocytozą o niejasnym pochodzeniu

  • 12-letni kot z utrzymującą się ponad 2 miesiące limfocytozą i nieznacznymi cechami atypii prezentowanymi przez limfocyty w badaniu mikroskopowym rozmazu
  • analiza cytometryczna próbki krwi pacjenta pozwoliła na identyfikację wyraźnie dominującej w populacji limfocytów subpopulacji komórek o fenotypie CD18+CD5+CD4+, który odpowiada limfocytom T pomocniczym. Zgodnie z danymi literaturowymi* taki wynik immunofenotypowania jest silną sugestią procesu nowotworowego linii limfoidalnej (białaczki lub chłoniaka w stadium białaczkowym).

*Rout E.D., et al. Immunophenotypic characterization and clinical outcome in cats with lymphocytosis. Journal of veterinary internal medicine 2020; 34: 105-116.

 

Strefa FAQ

Wy pytacie – my odpowiadamy

1. Jaką objętość materiału muszę przesłać, aby badanie mogło zostać wykonane?

Minimalna komórkowość materiału umożliwiająca przeprowadzenie badania to ok. 2-3 mln żywych komórek. Objętość próbki jaką należy przesłać do analizy zależy od ilości pobranych komórek i dlatego jest trudna do sprecyzowania. W przypadku krwi bez znacznej leukopenii i z obecnością istotnej populacji komórek, które mają być przedmiotem analizy, wystarczająca będzie standardowa probówka morfologiczna (1-2 ml). W przypadku bioptatów cienkoigłowych węzłów chłonnych/innych narządów dobrą zasadą jest pobieranie takiej ilości materiału, jak do wykonania kilku preparatów cytologicznych i/lub do osiągnięcia widocznego zmętnienia medium transportowego.

2. Dlaczego konieczne jest przesłanie specjalnej ankiety i preparatów cytologicznych?

Nasz wynik analizy cytometrycznej nie jest wyłącznie liczbą. Zdajemy sobie sprawę, że interpretacja tak zaawansowanego i rzadkiego badania może być dla lekarzy praktyków wyzwaniem, dlatego pomagamy w wyciągnięciu przydatnych diagnostycznie wniosków. Wykorzystujemy w tym celu znajomość najnowszej literatury, ale niezbędna jest również korelacja wyniku z wiedzą o pacjencie i obrazie cytomorfologicznym badanych komórek. W ten sposób efektywniej pomagamy, ale też budujemy własne doświadczenie, z którego mogą korzystać kolejni klienci i ich pacjenci.

3. Mój pacjent jest już w trakcie leczenia. Czy mogę wykonać badanie?

Ekspresja antygenów na powierzchni i w cytoplazmie komórek to zjawisko bardzo wrażliwe na działanie różnorodnych czynników, w tym starzenia się komórek, gwałtownych zmian temperatury czy przechowywania w warunkach in vitro. Szczególnie istotny wpływ na zmiany w ekspresji mają leki zmieniające cykl komórkowy i indukujące apoptozę (glikokortykosteroidy, cytostatyki). Po ich zastosowaniu ryzyko uzyskania wyników zafałszowanych (występowanie aberracji, czyli nieprawidłowości ekspresji) jest wysokie. Nie istnieją przy tym żadne wytyczne odnośnie do czasu odstawienia konkretnego leku, po którym badanie może być bezpiecznie wykonane. Decyzja o wykonaniu immunofenotypowania powinna być zatem podejmowana przed pierwszą dawką leku, a w przypadku badania po rozpoczęciu terapii – ryzyko zafałszowania wyniku musi być wzięte pod uwagę przez lekarza prowadzącego i właściciela.

4. Czy mogę wykonać to badanie zamiast oceny rozmazu krwi czy cytologii węzłów chłonnych?

Immunofenotypowanie jest badaniem zaawansowanym i dodatkowym, które nie może zastępować badań podstawowych. Ocena rozmazu krwi czy cytologia węzłów chłonnych muszą zostać wykonane wcześniej, chociażby w celu sprawdzenia, czy istnieje wskazanie do wykonania dalszych badań (w tym oceny immunofenotypu komórek).

5. Rozpoznałem/podejrzewam u mojego pacjenta chłoniaka – czy materiałem do badania może być krew?

Chłoniak jest nowotworem wywodzącym się z narządów litych a podstawową zasadą cytometryczną jest badanie źródła komórek nowotworowych. A zatem w przypadku chłoniaka materiałem do badania będzie zawiesina bioptatów węzłów chłonnych/innych narządów. Wyjątek stanowi ostatnie stadium zaawansowania chłoniaka, kiedy komórki nowotworowe naciekają szpik kostny i krążą we krwi obwodowej. Jeśli istnieje takie podejrzenie na podstawie oceny mikroskopowej rozmazu krwi – możliwe jest jej badanie pod kątem ustalenia immunofenotypu komórek nowotworowych.

6. Podejrzewam u mojego pacjenta białaczkę – jaki materiał do badania należy przesłać?

Jeśli ocena mikroskopowa krwi wskazuje na jej obraz białaczkowy – próbka krwi będzie idealnym materiałem do immunofenotypowania. Istotne jest, aby pamiętać, że populacja komórek atypowych musi być istotna, aby mogła zostać poddana rzetelnej ocenie (min. 10-20% leukocytów krwi). Jeśli krew nie zawiera istotnej populacji komórek, które mają być immunofenotypowane (podejrzenie białaczki aleukemicznej) właściwym materiałem do badania będzie szpik kostny.

7. Różnicowanie białaczki ostrej i przewlekłej u kota - czy immunofenotypowanie metodą cytometrii przepływowej odpowie na moje pytanie?

Niestety nie – brak przeciwciała skierowanego przeciwko kociemu antygenowi komórek progenitorowych CD34 uniemożliwia wykonanie tego zadania. Jest ono możliwe tylko u psów.

Kontakt

Vetlab Warszawa

telefon: +48 22 201 16 49
Aleja Krakowska 110/114 bud. B-55
02-256 Warszawa

email: cytometria@vetlab.pl

osoby do kontaktu:

  • dr n. med. lek. wet. Marta Idziak
  • lek. wet. Edyta Czech​