Ilość i przygotowanie materiału – kiedy jakość próbki decyduje o jakości wyniku
W diagnostyce laboratoryjnej jakość wyniku zaczyna się jeszcze przed uruchomieniem analizatora. Odpowiednia ilość materiału, jego właściwe przygotowanie, prawidłowe oznaczenie oraz czas, jaki upływa od pobrania do oddzielenia surowicy od elementów morfotycznych krwi, mogą bezpośrednio wpływać na możliwość wykonania badania i wiarygodność uzyskanego wyniku.
W przypadku materiału przekazywanego do laboratorium kluczowe znaczenie ma przede wszystkim to, co dzieje się z próbką od momentu pobrania do chwili przekazania jej kurierowi.
Ile materiału należy przesłać?
Objętość potrzebna do wykonania badania nie odpowiada wyłącznie ilości materiału zużywanej w samej reakcji. Konieczna jest również objętość umożliwiająca prawidłowe pobranie próbki przez analizator, a dodatkowy materiał może być potrzebny do powtórzenia badania, weryfikacji wyniku lub wykonania rozcieńczenia.
Przy szerokich profilach znaczenie ma więc nie tylko liczba oznaczeń, ale również rzeczywista objętość dostępnej surowicy. Jeśli możliwości pobrania krwi są ograniczone, warto wcześniej sprawdzić minimalne wymagania materiałowe i wskazać badania o największym znaczeniu klinicznym.
Pełna probówka krwi to nie pełna probówka materiału do badań
W przypadku badań wykonywanych z surowicy istotna jest ilość materiału uzyskana po wykrzepieniu i odwirowaniu krwi, a nie sama objętość krwi pełnej.
Surowica stanowi zwykle około 40–60% objętości krwi pełnej, przy czym rzeczywista ilość zależy m.in. od hematokrytu pacjenta. Oznacza to, że z 1 ml pobranej krwi można uzyskać około 0,4–0,6 ml surowicy, a u pacjenta z wysokim hematokrytem – jeszcze mniej.
Co dzieje się z próbką przed odbiorem przez kuriera?
Krew przeznaczoną do uzyskania surowicy należy pozostawić do całkowitego wykrzepienia – zwykle przez około 20–30 minut w temperaturze pokojowej – a następnie odwirować i oddzielić surowicę od skrzepu.
Nie należy pozostawiać nieodwirowanej krwi przez kilka godzin w oczekiwaniu na odbiór materiału. Komórki nadal pozostają metabolicznie aktywne, a przedłużony kontakt surowicy z elementami morfotycznymi może zmieniać skład próbki.
Przykładowo, stężenie glukozy może z czasem ulegać obniżeniu, a do surowicy mogą uwalniać się składniki obecne w wysokich stężeniach wewnątrz komórek, m.in. potas, fosforany oraz niektóre enzymy wewnątrzkomórkowe, zwłaszcza AST i LDH. Jeszcze większe znaczenie ma hemoliza, podczas której dochodzi do bezpośredniego uwolnienia zawartości erytrocytów do próbki.
Zmiany te zachodzą in vitro, już po pobraniu krwi, i mogą nie odzwierciedlać rzeczywistego stanu pacjenta w momencie pobrania. Po oddzieleniu surowicy materiał należy odpowiednio zabezpieczyć do czasu przekazania kurierowi. Dalszy transport odbywa się w kontrolowanych warunkach chłodniczych.
Odwirowanie pozwala również ocenić jakość i ilość materiału
Po oddzieleniu surowicy można ocenić zarówno rzeczywiście dostępną objętość materiału w odniesieniu do zleconych badań, jak i cechy próbki mogące wpływać na oznaczenia laboratoryjne, m.in. hemolizę, lipemię czy ikterię.
Pozwala to jeszcze przed przekazaniem próbki do laboratorium ocenić, czy ilość i jakość materiału są odpowiednie do wykonania zleconych badań.
Szczególnie istotna jest hemoliza – nie jest ona wyłącznie zmianą wyglądu próbki, ale oznacza uwolnienie składników erytrocytów do surowicy i może zmieniać wyniki części oznaczeń.
Prawidłowe oznaczenie materiału – dlaczego ma znaczenie?
Rodzaj materiału wskazany w Panelu Klienta lub na skierowaniu powinien odpowiadać temu, co faktycznie zostało przesłane do laboratorium.
Jeżeli do badania przesyłane jest osocze heparynowe, nie powinno być ono rejestrowane jako surowica. Choć oba materiały mogą być wykorzystywane w wielu oznaczeniach biochemicznych, nie są równoważne. Obecność antykoagulantu oraz różnice wynikające ze sposobu przygotowania próbki mogą wpływać na wyniki wybranych parametrów, a charakterystyka metody i zakresy referencyjne mogą być określone dla konkretnego rodzaju materiału.
Ma to szczególne znaczenie także podczas monitorowania pacjenta – kolejne wyniki najlepiej porównywać, jeśli badania wykonywane są z tego samego rodzaju materiału.
Czy zbyt małą ilość materiału można rozcieńczyć?
Rozcieńczenie może pozwolić na zwiększenie objętości próbki dostępnej dla analizatora, ale nie jest rozwiązaniem równoważnym z wykonaniem badań z materiału nierozcieńczonego.
Każda metoda ma określony zakres pomiarowy (dynamiczny). Jeśli stężenie analitu przekracza jego górną granicę, rozcieńczenie może być celowym elementem procedury i pozwolić na wykonanie wiarygodnego oznaczenia.
Inaczej wygląda sytuacja, gdy próbkę rozcieńcza się wyłącznie z powodu małej objętości. Wtedy nie znamy jeszcze wartości poszczególnych parametrów, a rozcieńczenie obniża stężenie wszystkich analitów.
Może się więc zdarzyć, że po rozcieńczeniu część parametrów znajdzie się bardzo blisko dolnej granicy zakresu pomiarowego lub poniżej niej. Matematyczne przeliczenie wyniku przez współczynnik rozcieńczenia nie przywraca wówczas dokładności utraconej na etapie pomiaru.
Im mniejsze rozcieńczenie, tym lepiej
Jeżeli rozcieńczenie z powodu ograniczonej ilości materiału jest konieczne, powinno być możliwie najmniejsze. W praktyce preferowane są niewielkie, najczęściej 2- lub 3-krotne rozcieńczenia, a większych staramy się unikać ze względu na rosnące ryzyko pogorszenia jakości wyniku.
Im większe rozcieńczenie, tym większe znaczenie mają:
- możliwość przesunięcia części parametrów w okolice dolnej granicy zakresu pomiarowego,
- błędy związane z odmierzaniem bardzo małych objętości,
- wpływ matrycy próbki.
Nie wszystkie parametry i metody reagują na rozcieńczenie w taki sam sposób. Poszczególne testy mają różne zakresy pomiarowe i różne ograniczenia dotyczące rozcieńczania.
Szczególne ograniczenia dotyczą oznaczeń hormonalnych wykonywanych metodą chemiluminescencyjną. Dla wielu z nich rozcieńczanie próbki w celu zwiększenia jej objętości nie jest zwalidowane i może wpływać na wiarygodność wyniku. Przy bardzo małej ilości materiału wykonanie części badań może więc nie być możliwe.
Mała objętość próbki – warto wskazać badania priorytetowe
Jeśli dostępna ilość materiału jest bardzo mała, bardziej wiarygodnym rozwiązaniem może być wykonanie wybranych badań o największym znaczeniu klinicznym niż próba wykonania całego szerokiego profilu po znacznym rozcieńczeniu próbki.
Dlatego w przypadku spodziewanych problemów z ilością materiału warto zaznaczyć na zleceniu, które oznaczenia mają charakter priorytetowy.
Najważniejsze zasady przygotowania materiału
Kilka prostych zasad może istotnie ograniczyć ryzyko problemów z wykonaniem badań i interpretacją wyników:
- przed pobraniem warto sprawdzić rodzaj i minimalną ilość materiału wymaganą dla planowanych badań;
- przy szerokich profilach należy pamiętać, że z pobranej krwi uzyskuje się orientacyjnie około 40–60% jej objętości w postaci surowicy;
- krew przeznaczoną do uzyskania surowicy należy pozostawić do całkowitego wykrzepienia – zwykle przez około 20–30 minut – a następnie odwirować i oddzielić surowicę od skrzepu;
- nie należy pozostawiać nieodwirowanej krwi przez kilka godzin do czasu odbioru przez kuriera;
- w systemie lub na skierowaniu należy zawsze wskazać rzeczywiście przesłany rodzaj materiału;
- nie należy zakładać, że zbyt małą objętość próbki zawsze można skompensować poprzez jej rozcieńczenie;
- jeżeli ilość materiału jest ograniczona, warto wskazać badania priorytetowe.
Jakość materiału jest częścią wyniku
Nowoczesne analizatory umożliwiają wykonywanie wielu oznaczeń z niewielkich objętości materiału, ale nie eliminują ograniczeń związanych z fazą przedanalityczną.
Odpowiednia ilość próbki, szybkie oddzielenie surowicy od elementów morfotycznych oraz prawidłowa informacja o rodzaju przesłanego materiału są istotnym elementem zapewnienia, że uzyskany wynik możliwie wiernie odzwierciedla stan pacjenta w momencie pobrania próbki.
